STM｜最新研究：KDM4是横纹肌肉瘤潜在治疗靶点

健康学术经纬· 2022-10-29

撰文 | 胡峰源责编 | 周叶斌

儿童横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma，RMS）是一种在肌肉组织中形成恶性（癌）细胞的疾病，通常起始于连接骨骼并帮助躯体运动的肌肉中，由本应发展成骨骼肌的细胞所长成的癌症，是发病率最高的儿童软组织肉瘤。

研究者们还不知道大部分RMS病例的成因，但有可能是DNA中染色体异位造成。当少量DNA从细胞里的一条染色体转移到另一条染色体的时候，细胞里的某些基因可以被开启。这种改变被称为染色体易位，常在一个细胞分裂成两个新细胞的时候产生。这可能是造成大部分肺泡横纹肌肉瘤（Alveolar rhabdomyosarcoma, aRMS，横纹肌肉瘤主要类型之一）病例里癌变的原因。在这些癌症中，2号染色体（或者1号染色体）上的一小片转移到了13号染色体上，这导致一个叫PAX3（或PAX7）的基因转移到紧靠另一个叫FOXO1的基因旁边。胚胎肌肉组织开始形成时，PAX基因在细胞生长中起到重要作用，而一旦不需要的时候它们通常就会被关闭；FOXO1基因的正常作用是激活其他的基因。所以当这两个基因移在一起，就可能会激活PAX基因，导致肿瘤形成。核心转录调节回路（Core regulatory circuit，CRC）是一组相互连接的自动调节转录因子，它们形成环并可被超级增强子(superenhancer，SE) 识别。PAX-FOXO1融合蛋白就控制着这样一个CRC，并通过表观遗传重编程SE促进肿瘤生长。其中KDM4B（组蛋白赖氨酸去甲基化酶4B）对这类融合阳性的肿瘤的生长不可或缺。

2022年7月，美国圣裘德儿童医院杨俊教授团队于Science Translational Medicine发表题为Targeting KDM4 for treating PAX3-FOXO1–driven alveolar rhabdomyosarcoma的研究论文，该研究发现，抑制 KDM4B可促进肿瘤消退，表明KDM4B可能是PAX-FOXO1+ RMS这类恶性儿童肿瘤潜在的治疗靶点。

基因转录失调是肿瘤标志性特征之一，其引导癌细胞转向依赖异常的转录程序。尤其是一小组相互关联的转录因子可以形成CRC来建立和维持各类癌细胞的身份和特征。嵌合转录因子（Chimeric transcription factor，CTF）在构建癌症转录因子网络中起重要作用。融合基因PAX-FOXO1就是一种嵌合转录因子，并且是已知的致癌驱动因子。尽管这些转录因子对癌细胞的存活至关重要，但对它们有选择性地靶向依然是一项有挑战性的工作。

部分aRMS的转化主要由PAX3-FOXO1 或其变体 PAX7-FOXO1 融合蛋白驱动。PAX3-FOXO1 阳性 aRMS 比阴性 RMS 更具侵袭性，转移率更高，预后更差。尽管目前的治疗方式稳步提高了低风险 RMS 患者的生存率，但对于高风险，特别是融合阳性 RMS 患者的结果仍然令人沮丧。在少数治愈的患者中，积极的化疗和放疗往往会导致长期的不良反应，包括继发性恶性肿瘤。因此，迫切需要更好地了解融合阳性 RMS 的生物学，以开发更有效的疗法。

以往研究发现组蛋白赖氨酸去甲基化酶(KDM) 在嵌合转录因子驱动的许多癌症中活性失调。例如，KDM1A 与EWS-FLI1 相互作用，介导尤文肉瘤中肿瘤抑制因子的转录抑制，并维持 MLL-AF9 白血病干细胞的致癌潜力。SS18-SSX 癌蛋白被 KDM2B 募集以驱动滑膜肉瘤。而 MLL-AF9 介导的白血病发生需要 KDM4 家族成员的参与。MLL-GAS7 和 MOZ-TIF2 通过 KDM4C 介导急性髓细胞白血病的表观遗传重编程和转化。总之，这些数据表明，致癌融合转录因子需要KDM来进行肿瘤转化。然而，KDM是否参与由CTF控制的转录因子网络的维护尚不清楚。作者在本研究中揭示双重 H3K9me3/me2 和 H3K36me3/me2 去甲基化酶 KDM4B 是 PAX3-FOXO1 驱动的 aRMS 中关键转录因子的可靶向调节因子。

首先作者揭示KDM4B的RNA表达在aRMS样本中失调。通过和正常肌肉组织对比，四个KDM基因（KDM4B，KDM3A，KDM5A，KDM5B）在RMS中高表达（P

KDM4B在aRMS样本中表达失调，并且受PAX3-FOXO1调控

接下来作者使用相同细胞系敲除KDM4B，其大大降低了PAX3-FOXO1的表达（2.4-fold）, 这项数据显示KDM4B至少部分调控PAX3-FOXO1基因转录。两者在表达上相互调控表明两者高度相互依赖。以往的数据曾经揭示KDM4B与谱系特有转录因子ERα和MYCN有相互接触。在这个基础上作者测试了KDM4B与PAX3-FOXO1是否同样存在直接接触。通过不同试验的验证（免疫共沉淀，分析型超速离心机），作者揭示在aRMS细胞中，KDM4B与PAX3-FOXO1形成了一个蛋白复合体。

KDM4B与PAX3-FOXO1存在直接接触

作者接下来研究了KDM4B在PAX3-FOXO1 aRMS中的功能，并发现KDM4B驱动细胞增殖和肿瘤生成。首先作者设计了功能丧失型（loss-of-function）试验，在细胞系（Rh30和Rh41）中敲除KDM4B减缓了肿瘤生长。进一步分析表明KDM4B可能对维持aRMS的分化区块 (differentiation block) 起了一定作用。在对KDM4B敲入的功能获得型（gain-of-function）试验中显示出其对肿瘤生长的促进作用。综合数据显示KDM4B是PAX3-FOXO1 aRMS的治疗漏洞（therapeutic vulnerability）。进一步的细胞系 (JR1) 试验显示KDM4B在融合阴性的RMS中也有促癌作用，但是起到的功能可能不尽相同。

KDM4B在PAX3-FOXO1 aRMS中驱动细胞增殖和肿瘤生成

作者接着指出，目前Celgene开发出了一种强效，选择性与细胞渗透性好的KDM4小分子抑制剂QC6352，它对KDM4家族成员的特异性要高出其他KDM家族成员很多倍（15-fold+ to KDM5，70-fold+ to others），并且适用于口服。质谱实验和结构分析显示QC6352和KDM4可紧密结合，对KDM4起到抑制作用。接下来作者检测了QC6352对癌细胞的作用。Western blot结果显示QC6352不但降低了KDM4B和PAX3-FOXO1丰度，同时也影响到了PAX3-FOXO1的关键靶向基因如FGFR4, MYCN和MYOD1。作者进一步揭示QC6352引发了蛋白酶体降解。

作者下一步验证对KDM4B药理上的抑制是否有治疗效果。总体看来PAX-FOXO1+ RMS细胞系对QC6352的敏感程度高出PAX-FOXO1- RMS细胞系两倍多。人类正常肌肉细胞系对QC6352有抗药性，进一步验证了其安全性。同时试验数据显示，敲除KDM4B后细胞对QC6352产生了抗药性，揭示KDM4B是QC6352主要的治疗靶点。

药物抑制KDM4B在PAX-FOXO1 aRMS中显示抗癌活性

作者进一步探索了QC6352抑制加上传统化疗在PAX-FOXO1 aRMS模型上的治疗效果，发现了QC6352还抑制了DNA修复相关基因 (MLH1, BRAC2和TOP2A) 的表达。其数据验证了 QC6352在靶向PAX-FOXO1的同时也加强了肿瘤对导致DNA损坏的化疗的反应，从而加强了标准治疗方案的有效性。