在多种妇科肿瘤中，卵巢癌（OvCa）的死亡率高居首位，且大多数患者在诊断时已存在腹膜转移[1]。因为卵巢直接暴露于腹腔，与其他易于转移到实体器官（如肺和肝）的肿瘤不同，OvCa很少通过血液转移，而更容易发生腹膜转移[2]。
OvCa可以在腹膜、网膜、肠系膜等广泛转移，手术难以完全清除肿瘤，治疗效果较差。目前临床主要依靠顺铂、紫杉醇等化疗药物实现完全缓解。尽管近年来靶向药物的研发延长了患者的无进展生存期，但这些药物在延长总生存期方面作用仍然有限[3-4]，对于OvCa的腹膜转移，仍然缺乏有效的治疗方法。
近日，来自名古屋大学的研究团队在Matrix Biology发表重要研究，他们发现，维生素D可以促进THBS1表达正常化，抑制间皮细胞间充质转化，并逆转肿瘤相关间皮细胞的间充质状态，从而抑制OvCa的腹膜转移[5]。
文章封面
有研究认为，控制腹膜转移可能在改善OvCa的难治性方面发挥重要作用。OvCa细胞从原发部位脱落后，经腹水携带至腹膜壁、肠系膜和大网膜等。正常情况下，这些部位被间皮细胞（MCs）覆盖，保护内脏免受病原体和肿瘤细胞的伤害[6]。许多研究表明，在肿瘤微环境中MCs具有促癌作用。
癌症相关的成纤维细胞（CAFs）是肿瘤基质中数量最多的细胞，可以产生各种促进肿瘤细胞生长的因子。在之前的研究中，研究团队证实了腹膜转移的OvCa基质中存在许多MC来源CAFs[7]。
在腹膜转移过程中，肿瘤细胞分泌的TGF-β1诱导上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程的发生，MCs转化为间充质状态。EMT诱导的MCs被称为肿瘤相关间皮细胞（CAMs），是促进OvCa进展的肿瘤微环境中重要的组成部分。结合既往研究结果，研究团队认为抑制CAMs的活性可能有助于OvCa的治疗。
有研究表明，维生素D不仅可以在维持钙稳态和调节骨代谢中发挥关键作用，还可以抑制细胞周期、增殖和血管生成等[8]。此外，已证实维生素D受体（VDR）的过表达与各种癌的良好预后相关[9]。
因此，研究团队推测，维生素D可以通过抑制MCs的EMT发挥抗肿瘤作用，从而治疗腹膜转移。
机制图
首先，研究团队对MCs的特异性标志物calretinin进行免疫组化（IHC），以确定MCs在大网膜转移的定位。结果显示，腹膜表面、肿瘤细胞浸润大网膜的区域都存在MCs，而OvCa原发部位未观察到MCs。研究团队接着检测了MCs和CAMs中VDR的表达，发现大网膜表面排列的MCs呈VDR阳性，网膜转移瘤的间质中也存在许多VDR阳性的MCs。多重免疫组化进一步验证了这一结论。
OvCa腹膜转移中可见来自MCs的VDR阳性成纤维细胞
研究团队还分析了公共数据库中的数据，发现VDR表达水平是OvCa一个重要的预后因素。在所有分期和III期OvCa患者中，VDR高表达的患者死亡风险降低25%（P=0.0013，P= 0.0056）。此外，VDR在基质细胞中的表达高于肿瘤细胞。这些结果表明，VDR在间质（包括MCs）的高表达与OvCa患者更好的预后相关。
VDR高表达与OvCa患者更好的预后相关
前期研究已经证明OvCa的恶性腹水诱导了MCs的EMT，而TGF-β1是MCs中EMT的主要诱导因子。研究团队探索了TGF-β1存在时维生素D对MCs的影响。结果表明维生素D可以纠正TGF-β1刺激导致的MCs形态改变、E-cadherin表达水平降低、aSMA表达水平升高等。维生素D还可以减轻TGF-β1刺激诱导的EMT标志物水平的增加，如N-cadherin、MMP2、MMP9和Slug等。这些数据表明，维生素D通过改变EMT标志物的形态和表达，减弱TGF-β1诱导的MCs EMT。
维生素D抑制TGF-β1诱导的上皮-间充质转化
接下来，研究团队对不同处理组的MCs进行RNA测序并进行分析，发现维生素D干预下调了EMT和局灶性粘连相关基因的表达。其中血栓反应蛋白-1（thrombospondin-1，THBS1）的表达在TGF-β1刺激的MCs中高度上调（27.90倍），并且在维生素D干预后下调最明显。qRT-PCR验证THBS1表达的变化后，研究团队分析了THBS1在OvCa患者中的表达。公共数据库的数据表明，THBS1高表达是不良预后因素（HR，1.35;P=0.0018）。
维生素D可下调促进粘附的关键蛋白THBS1的表达
因此研究团队推测，MCs中THBS1表达的增加可能促进OvCa细胞在腹膜的粘附，维生素D通过抑制THBS1的表达抑制MCs粘附。为了验证这一假设，团队进一步研究了维生素D对OvCa细胞粘附于MCs的影响。
实验结果显示，TGF-β1刺激的MCs中THBS1表达显著上调（79倍，P＜0.0001），而添加维生素D会显著抑制THBS1的表达。此外，维生素D以浓度依赖的方式抑制OvCa细胞的粘附和增殖，THBS1以浓度依赖的方式增强OvCa细胞的粘附。
接下来，研究团队研究了维生素D介导的THBS1抑制的分子机制。既往研究已经证明，TGF-β信号通过配体与细胞表面表达的TGF-β受体复合物结合启动，然后通过磷酸化激活Smad2和Smad3，激活的Smad2/3与Smad4形成复合物，并通过与DNA结合作为转录因子来调控靶基因的表达。维生素D可通过VDR抑制Smad3的磷酸化。
本研究表明，VDR与Smad3竞争结合到THBS1的启动子区，抑制THBS1的转录。因此，维生素D通过抑制Smad3与DNA的结合抑制THBS1在MCs中的表达，从而抑制OvCa细胞与MCs的粘附。
维生素D通过VDR/Smad3竞争抑制THBS1抑制OvCa细胞粘附和增殖
研究团队还发现，维生素D处理后，MCs恢复上皮样状态，MCs中E-cadherin水平升高，actin应激纤维和THBS1的表达降低。在间充质状态下，MET不能自发或独立地诱导到上皮样状态，实验结果表明维生素D可以部分逆转稳定的MCs间充质状态。即使在肿瘤细胞存在的情况下，维生素D也能诱导处于间充质状态的MCs中MET，并使THBS1表达正常化。
维生素D可恢复TGF-β1诱导的MCs EMT和THBS1表达
最后研究团队在小鼠模型中验证了这些结果。体内实验表明，维生素D干预的小鼠腹膜表面THBS1表达水平、缺陷微绒毛面积、OvCa细胞腹腔播散率均低于单独TGF-β1处理的小鼠。蛋白免疫印迹和免疫荧光分析显示，维生素D处理后，随着MET诱导，腹膜表面THBS1表达恢复。
维生素D在体内可保护腹膜微绒毛，减少腹膜播散
总而言之，本研究强调了MCs是OvCa腹腔转移的关键决定因素，发现维生素D通过抑制TGF-β1诱导的MCs间充质状态来抑制肿瘤的发生，并确定THBS1是增强OvCa细胞粘附和增殖的关键蛋白。在体内，维生素D通过VDR/Smad3竞争抑制Smad依赖的TGF-β信号，从而抑制腹膜播散。
这一发现有希望作为临床治疗的补充，改善晚期OvCa患者的预后。
参考文献
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责任编辑丨王雪宁
