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话越少，事儿越大，国产CAR-T，确实蛮猛！
今日，顶级期刊《自然》杂志发表了一项来自我国团队的重磅科研成果[1]，该研究提出了一种不经病毒转染、定点整合的CAR-T技术，并在小规模临床研究中取得了不错的疗效，针对复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤（r/r B-NHL）实现了87.5%的完全缓解率。
而且该技术工艺流程相较目前的CAR-T疗法更加简单、耗时更短、成本更低，这无疑能够大大拓展CAR-T疗法的可及性。
该研究来自浙江大学、华东师范大学及邦耀生物（BRL Medicine）的科研团队。
论文首页截图
近些年来，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法发展迅速，在癌症治疗、尤其是血液肿瘤治疗中表现出巨大的潜力。
举例来说，至今还是老大难问题的复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤（r/r B-NHL），常规疗法预后很差，抗体偶联药物等新疗法也没能啃下这块硬骨头[2]；相对的，CAR-T就能拿到50%的完全缓解率[3]。
但是必须承认的是，CAR-T疗法也有它独特的问题。疗效有待进一步提升，不良反应严重，生产流程复杂周期长，价格昂贵……CAR-T生产中还涉及病毒的使用，这又带来了安全性的隐患。
病毒是基因编辑的优秀载体，但是病毒诱导的插入诱变（insertional mutagenesis）可能增加癌症发生的风险[4]，病毒来源的DNA的特异性反应也可能阻碍CAR的表达[5]。此外，病毒也是高成本的原因之一[6]……
今天我们要说的这项研究，则提出了一个便捷的非病毒解决方案。研究者们通过电穿孔（electroporation）转染CRISPR-Cas9，利用双链DNA的同源定向修复（HDR），将目标基因定点整合到靶序列，实现了高效率的同源重组。
基因整合思路
研究者们首先构建了含有4-1BB和CD3ζ的抗CD19 CAR（19bbz），整合到AAVS1定点整合位点（safe harbors）。19bbz与AAVS1的融合效率约为10%（最高19.8%），插入缺失百分比为67%-87%。虽然电穿孔对细胞造成了一些损伤，但是T细胞扩增功能正常，并随后恢复了高细胞活性。
研究者对比了AAVS1-19bbz CAR-T和通过慢病毒转染的LV-19bbz CAR-T，发现AAVS1-19bbz CAR-T中CD8与CD4 T细胞比例明显更高，二者在表面标志物和细胞因子分泌上存在些许差异，但同样能在体内体外表现出良好的抗肿瘤活性。
AAVS1-19bbz与LV-19bbz CAR-T均具有良好的抗肿瘤活性
大家都很熟悉的PD-1/PD-L1通路，可以进一步增强CAR-T的抗肿瘤活性，研究者们搞了个锦上添花的操作，将19bbz直接整合到了PD1基因中，这样制造出的加强版PD1-19bbz CAR-T就基本不表达PD-1了。
同样对比慢病毒转染及敲除PD1的CAR-T，PD1-19bbz明显具有更强的抗肿瘤活性，小鼠生存率有了大幅度提升。
PD1-19bbz明显具有更强的抗肿瘤活性
那么在人体中，PD1-19bbz也能保持这样的优秀吗？
患者首先经环磷酰胺和氟达拉滨联合化疗，然后输注一次PD1-19bbz CAR-T，剂量为0.56×106-2.35×106个细胞/kg。部分患者中观察到轻度细胞因子释放综合征（CRS），没有观察到免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。
在12个月的中位观察期内，8名患者有7名（87.5%）实现了完全缓解（CR），最后一次随访时有5名患者仍有持久的反应。
值得注意的是，PD1-19bbz CAR-T的输注剂量并不高，CAR-T占比也很低，在这种情况下仍能取得比较好的疗效，说明PD1-19bbz的抗肿瘤活性是相当高的。
PD1-19bbz具有高安全性和有效性
随后的单细胞测序结果也显示，无论整合位点如何，通过电穿孔转染定点整合的CAR-T中CD8记忆T细胞的占比更高。
输注后，它们也表现出一些记忆基因的持续表达，以及功能障碍基因的表达降低。基因富集分析（GSEA）显示，PD1-19bbz在体内具有更高的增殖和免疫应答能力。
简而言之，PD1-19bbz的记忆T细胞数量更多、抗肿瘤活性更强，这就是它优秀疗效的秘密了。
不同制备方法的两个供体样品中细胞占比
相对目前CAR-T产品，这项研究无疑提供了一个新的、更低成本高效的解决方案。而CRISPR-Cas9介导的非病毒基因特异性靶向的思路，在CAR-T之外的其他细胞治疗中，也有着更广阔的用武之地。
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参考资料：
[2]Papageorgiou, S. G., Thomopoulos, T. P.,Liaskas, A. & Vassilakopoulos, T. P. Cancers14, 1917 (2022).
[3]Zhao, H. et al. Front. Med. 14, 711–725(2020).
[4]Michieletto, D., Lusic, M., Marenduzzo, D. & Orlandini, E. Physical principles of retroviral integration in the human genome. Nat. Commun. 10, 575 (2019).
[5]Atianand, M. K. & Fitzgerald, K. A. Molecular basis of DNA recognition in the immune system. J. Immunol. 190, 1911–1918 (2013).
[6]Gandara, C., Affleck, V. & Stoll, E. A. Manufacture of third-generation lentivirus for preclinical use, with process development considerations for translation to Good Manufacturing Practice. Hum. Gene Ther. Methods 29, 1–15 (2018).
本文作者丨代丝雨
